默克生命科学|荧光原位杂交（FISH）

试剂和设备

1. 20X 柠檬酸钠缓冲液（SSC：3 M NaCl，0.3 M柠檬酸钠，pH 7或产品货号S6639）更多内容请到默克生命科学官网查看：www.sigmaaldrich.cn

2. RNase A（产品货号R4642）100 µg/ml于2x SSC中

3. 胃蛋白酶（产品货号P6887） 40单位/ml于10 mM HCl中

4. 多聚甲醛，EM级（产品货号P6148）新近解聚的，4% w/v于水中

5. 乙醇

6. 标记的探针。通过缺口平移随机引物或聚合酶链反应（如ADVANCE™缺口平移试剂盒）而对质粒DNA进行生物素-11-dUTP标记

7. 杂交混合液：50％甲酰胺（产品货号F7508）、10％硫酸葡聚糖（产品货号D8906）、0.1％ SDS（产品货号L4390）、0.5-1.5 ng/µl标记的探针和300 ng/ml鲑鱼精子DNA（产品货号D7656）于2x SSC中

8. 洗涤缓冲液：20％甲酰胺（产品货号F7508）于0.1x SSC中

9. 检测缓冲液：0.2% Tween 20（产品货号P1379）于4x SSC中

10. 封闭缓冲液：5% 牛白蛋白（产品货号A3803）于检测缓冲液中

11. 抗体或检测化合物（如链霉亲和素-Cy3，产品货号S6402）于封闭缓冲液中

12. DAPI（产品货号D9542）2 µg/ml于抗荧光淬灭封片剂中。

13. 荧光显微镜、滤光片和可选的三带通滤波器（x58，Omega Optics）

14. 玻片（产品货号S8400）

15. 用于孵育和杂交步骤的塑料盖玻片（从可高压灭菌的垃圾袋切下，如产品货号B4408）

16. 热模块/ 改进的热循环仪

17. 用于洗涤步骤的科普林缸（产品货号S6016、S5641或S5891）

操作流程

玻片制备

1. 从任何细胞类型开始染色体制备。

2. 在37 °C下用200 µL RNase孵育1小时

3. 在2x SSC中洗涤玻片5分钟。重复。

4. 在10 mM HCl中漂洗玻片。

5. 在37 °C下用200 µL胃蛋白酶孵育10分钟。

6. 在去离子H2O中漂洗玻片。

7. 在2x SSC中洗涤玻片5分钟。重复。

8. 在多聚甲醛中固定玻片10分钟。

9. 在2x SSC中洗涤玻片5分钟。重复。

10. 在梯度乙醇中对玻片进行脱水：70%、80%、95%；每种2分钟。

11. 风干。

杂交

1. 每块玻片制备30 µl杂交溶液。加热至70 °C，维持10分钟后置于冰上。

2. 每块玻片上加入30 µl杂交溶液并盖上塑料盖玻片。

3. 在热模块上65-70 °C条件下对玻片进行变性5分钟。

4. 逐渐降温至37 °C。

5. 在湿度箱37 °C条件下杂交过夜。

检测

1. 在2x SSC中洗涤玻片以去除盖玻片。

2. 在洗涤缓冲液中40 °C条件下洗涤玻片5分钟。重复。

3. 在0.1x SSC中40 °C条件下洗涤玻片5-15分钟。

4. 在2x SSC中40 °C条件下洗涤玻片5-15分钟。

5. 将玻片冷却至室温。

6. 在检测缓冲液中平衡玻片5分钟。

7. 在封闭缓冲液中封闭20-30分钟。

8. 用50 µl 抗体或检测化合物孵育30-60分钟（如在封闭缓冲液中的5 µg/ml 链霉亲和素-Cy3）。

9. 在2x SSC中洗涤玻片5分钟。重复两次。

10. 用DAPI溶液复染10分钟。

11. 简短漂洗后在抗荧光淬灭封片剂中进行封片。

12. 用荧光显微镜进行分析。